Temas relacionados con el Medio Ambiente

MANEJO DE MUESTRAS

ALMACENAMIENTO CAMBIOS EN LAS PROPIEDADES DEL CONTENIDO DE LAS MUESTRAS

• El almacenaje de muestras de agua o de sedimento causa:

1. Ligera disminución en la población total, → rápido incremento en la población microbiana → continuo descenso en el número de especies detectables.
2. Magnitud de cambios: Está en función de: Composición y tamaño de la muestra, T°, disponibilidad de O2, exposición a la luz, presión hidrostática, etc.
3. A mayor área superficial del recipiente por unidad de volumen de muestra, más rápido y más grande es el incremento bacteriano.
4. Este incremento se atribuye en parte al hábito de muchas bacterias de adherirse a las superficies, en donde se concentra mayor cantidad de alimento.

Almacenamiento en C.N.L. (T° y presión atmosférica normal) de muestras del océano profundo → muerte de muchas bacterias psicrófilas y barófilas en pocas horas, pues son sensibles a temperaturas superiores a 20 °C y presiones hidrostáticas bajas.

• Consenso de los investigadores:

1. Almacenamiento a bajas temperaturas, sólo minimizan cambios, cuali y cuantitativos de la población microbiana, pero no la eliminan, aún a temperaturas tan bajas como 0°C.
2. Muy importante: analizar las muestras de agua o de sedimento tan pronto como sea posible, pues el almacenamiento a bajas temperaturas sólo tiene ligeras ventajas y es difícil asegurar presiones hidrostáticas originales.
3. Ante alternativa de almacenamiento de muestra: Condiciones del almacenamiento en el laboratorio, deben simular lo más cercano posible a las condiciones del ambiente natural del cual procede la muestra.

• METODOS CULTURALES Y DE ENUMERACION: Tomadas todas las precauciones debidas en el muestreo, el problema es luego:

Tener en cuenta si:

1.- Muestra contiene escasa cantidad de microorganismos:

*** Concentrar m’os en volumen de muestra:

Si el número de bacterias es tan pequeño

2. Muestra contiene elevado número de microorganismos:

- Dilución adecuada de las muestras:
Ej. muestras que contienen desechos orgánicos, aguas residuales muy contaminadas con materia orgánica y por lo tanto presenta gran cantidad de microorganismos. 


MEMBRANAS FILTRANTES

a) Filtracion del agua a travez de una membrana que retiene los microorganismos.
b) Adicion del caldo de cultivo apropiado para coliformes a la membrana
c) Conteo de colonias coliformes


ACETATO DE CELULOSE BRANCA LISA
NITRATO DE CELULOSE BRANCA LISA
NITRATO DE CELULOSE QUADRICULADA
POLIETERSULFONA
CELULOSE REGENERADA
POLIAMIDA

• Cultivo de bacterias acuáticas

→Utilizar medios de cultivo con ingredientes que satisfagan los requerimientos nutricionales.
→ Certes (1884) : adicionar agua de mar o NaCl al 3% para cultivo de bacterias marinas, →Creyeron conveniente adicionar extracto proteico de peces o extracto de suelo para el aislamiento de bacterias de peces o de sedimento.
→A pesar del avance logrado en el metabolismo de bacterias marinas, no se ha logrado un único medio capaz de soportar el crecimiento de todos los tipos de microorganismos, ni aún de todos los heterótrofos.

• Aislamiento de bacterias marinas:

En la preparación de medios de cultivo se utiliza :
Diluyente o disolvente adecuado:

- Agua de mar natural envejecida (AMNE), o
- Agua de mar artificial o
- Mezcla de sales básicas
Bajos niveles de Nutrientes:

ZOBEL(1941) propuso un medio llamado: 2216, ampliamente disponible y contiene:
- Peptona 0,5% - FeP04 0,01%
- Agar agar 1,5% y
- AMNE c.s.p. se recomienda para el cultivo de bacterias marinas.

CARLUCCI Y PRAMER, observan que adición de extracto de levadura al medio 2216 origina conteos en placa mucho más altos.

• Técnicas de siembra

- Placa vertida: Por incorporación; sin embargo, puede obtenerse conteos mucho más altos empleando la técnica de:

- Siembra en superficie: Técnica obligada y rutinaria para el cultivo de microorganismos marinos especialmente psicrófilos.

- Número Más probable (NMP): No recomendable para determinar la población bacteriana en general, pues demanda mucho tiempo, mucho material y los resultados son menos precisos.

Aplicación de N.M.P: Estimar la abundancia de diferentes tipos fisiológicos de bacterias, al emplear medios selectivos y diferenciales, con sustratos que van a ser atacados por grupos de bacterias especiales como: E. coli, sulfitorreductores, bacterias fotosintéticas, nitriificantes y otros.

























Elección del medio de cultivo adecuado (“ideal”)

• Técnicas de conteo
• 

- Placa vertida: (Incorporación)


- Siembra en superficie: (en césped, en manto)


- Número Más probable: (Tubos múltiples)


- Conteo microscópico directo.

• Técnica del Número Más probable (NMP)

• Conteo Microscópico Directo (C.M.D.): Número total de bacterias (vivas y muertas)

- Permite detectar entre 103 a 104 veces más bacterias en agua de mar y en sedimentos que el conteo en placa. Este hecho se debe a:
- Imposibilidad de cualquier medio para satisfacer los requerimientos culturales de todas las bacterias y
- Tendencia de las bacterias de asociarse en masas zoogleales, cadenas, racimos o a unirse a partículas sólidas. Al sembrar una muestra, cada partícula o agrupamiento dará lugar al desarrollo de una sola colonia; mientras que muchas células individuales asociadas a tales grupos pueden distinguirse microscópicamente.

C.M.D: Puede emplear:

1.- Cámaras de conteo:
-Petroff-Hauser: Desventaja, sólo podrán emplearse si es que el material a examinar contiene más de un millón de bacterias/ mL (más de 20x 106 para el uso de la cámara Petroff-Hauser).

2.- Membrana filtrante: Conteo directo por ultrafiltración:
- Es el más ampliamente usado debido a su simplicidad y aplicabilidad al estudio de muestras de agua y de sedimento.
- Consiste en filtrar un volumen determinado de agua a través de una M.F. de 0,1 a 0,3 micras de poro, las bacterias retenidas son fijadas coloreadas y contadas al microscopio.
- Existen otros métodos de aplicación muy específica.

• Identificación de bacterias marinas

- Esquemas de clasificación usados en Microbiología médica no son aplicados en la identificación de bacterias marinas, pues éstas tienen requerimiento salino específico, temperaturas de crecimiento diferentes y una falta de actividad contra la mayoría de azúcares.

- Sin embargo, son muy activas contra sustancias complejas: proteínas, almidones, quitina, celulosa, agar, ácido algínico, etc.

- Se hizo evidente la falta de un esquema de clasificación general y una lista de especies convenientemente clasificadas.

- Sistema API 20 E. estandarizado para identificación de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite realizar 23 pruebas bioquímicas a partir de una colonia bacteriana.
-API 10S, versión miniaturizada del API 20 E

1. TAXONOMÍA

Agrupa y estructura los organismos en (taxones) en base a su similitud

Asigna nombres a los taxones

- Identificación

Determina a que taxones pertenece un organismo que se aísla

2.- ESPECIE